DNA核酸浓度的测定实验应用方案（超微量紫外分光法）
DNA核酸浓度的测定实验应用方案（超微量紫外分光法）
引言寡核苷酸，单链、双链DNA，以及RNA可以定量溶于缓冲液，构成核酸的嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键，使核苷核和核酸在紫外线光具有特征性的吸收光谱，最大吸收峰为260nm。窄光带紫外分光光度计，长260nm．，比色杯光径1cm，1个吸光度值（1A）相当于50ug/ml双螺DNA，40ug/ml单螺旋DNA或RNA），20 ug/ml寡核苷酸。
测试前，选择正确的程序，输入原液和稀释液的体积，尔后测试空白液和样品液。然而，实验并非一帆风顺。读数不稳定可能是实验者最头痛的问题。灵敏度越高的仪器，表现出的吸光值漂移越大。
原理紫外分光光度法基于DNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收，DNA/RNA在260nm处有最大的吸收峰，蛋白质在28Onm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处。因此，可以用260nm波长进行分光测定核酸浓度，OD值为1相当于大约50ug/ml双链 DNA，单链DNA浓度约为33ug l ml，RNA约为40ug/ml，寡核苷酸约为35ug/ml。如用1cm光径，用 H,O稀释DNA/RNA样品n倍并以H,O为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度:
DNA (mg/ml ) =50×OD260 读数×稀释倍数/1000RNA (mg/ml) =40×OD260读数×稀释倍数/1000。
A280nm是蛋白和酚类物质最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估:纯DNA的A260/A280比值为1.8，纯RNA为2.0。假如比值低，表示受到蛋白（芳香族)
或分类物质的污染，需要纯化样品。比值=1.5相当于50%蛋白质/DNA溶液。
A230nm是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估:纯DNA和RNA的A260/A230比值为2.5。若比值小于2.0标明样品被碳水化合物（糖类）、盐类或有机溶剂污染，需要纯化样品。
A320nm或A340nm为检测溶液样品的浊度，该值应该接近0.0。假如不足，标明溶液中有悬浮物，需要纯化样品。
仪器及试剂
比色杯
样本DNA
双蒸水
测定
1、将制备的DNA悬浮溶解于TE缓冲液中 pH8.0，10mmo1L的Tris缓冲液，内含(1mmol/L EDTA)或悬浮溶解在灭菌水中(依据DNA含量加水)。
2、用可扫描的紫外分光光度计测定制备的DNA/RNA的紫外吸收曲线，测定OD260和OD280，并计算比值:OD260/OD280，纯 DNA的此比值约为1.8~2.0。纯RNA的此比值
约为大于2.0。
3、根据每毫升1微克的纯DNA的OD260值=0.020，计算所得 DNA的纯度:每毫升1微克的纯RNA的OD260值=0.025，计算所得RNA的纯度。
注意事项
OD值范围应该在0.1~0.99之间，否则不符合上述线性关系。
A260/A280比值可提供DNA纯度的一个参考，但A260/A280比值会受pH影响。如果未调pH，比值可能与实际差别很大。如果需要准确数值，建议在10 mM Tris Cl，pH 8.5中检测，此时纯净的 DNA A260/A280比值应为1.8-2.0（注意应使用同样缓冲液作为对照)
在测试时，离子浓度太高，也会导致读数漂移，因此建议使用pH值一定、离子浓度较低的缓冲液，如TE，可大大稳定读数。样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素：由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒，尤其是核酸样品。这些小颗粒的存在干扰测试效果。为了最大程度减少颗粒对测试结果的影响，要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值最好在0.1-1.5A。在此范围内，颗粒的干扰相对较小，结果稳定。从而意味着样品的浓度不能过低，或者过高（超过光度计的测试范围）。最后是操作因素，如混合要充分，否则吸光值太低，甚至出现负值；混合液不能存在气泡，空白液无悬浮物，否则读数漂移剧烈；必须使用相同的比色杯测试空白液和样品，否则浓度差异太大；换算系数和样品浓度单位选择一致；不能采用窗口磨损的比色杯；样品的体积必须达到比色杯要求的最小体积等多个操作事项。
仪器参数
UL-1000超微量紫外可见分光光度计产品参数
1．产品简介
超微量紫外可见分光光度计是一类很重要的分析仪器 ,无论在物理学、化学、生物学、医学、材料学、环境科学等科学研究领域 ,还是在化工、医药、环境检测、冶金等现代生产与管理部门 ,超微量紫外可见分光光度计都有广泛而重要的应用。超微量紫外可见分光光度计就是利用分光光度法对物质进行定量定性分析的仪器，常用于核酸，蛋白定量以及细菌生长浓度的定量。超微量紫外可见分光光度计已成为现代分子生物实验室常规仪器。
2．仪器特点
*检测所需样微量，最低只需0.5ul
*检测范围宽，比传统的分光光度计的上限高100倍
*对于多数样品而言，无需稀释
*机器无需预热，直接测量，无需检测容器，日常消耗低
*全波长190-1100nm，分辨率1nm，仪器都自动给出全波长的扫描结果190-850nm
*体积小巧，便携式包装，满足现场检测的需求
*通过PC控制实现更精确和灵活的测量
3．技术指标
*最小样本量：0.5μl
*光程：1mm/0.2mm
*波长范围：190～850nm
*波长精度：1 nm
*波长分辨率：≤0.3nm（FWHM 在 Hg 253.7nm）
*吸光率精度：2%（0.76 在 257nm）
*吸光率分辨精度：0.002Abs（1mm 光程）
*吸光率范围：0.02～300 (等效10mm光程)
*可准确测量范围：0.1～5 Abs. ±0.1Abs 5～80 Abs. ±2%
*侦测器：3648像素线性CCD阵列
*光源：微型氙气闪光灯系统
*测量时间：<5 秒
*尺寸：200mm×130mm×136mm（L×W×H）
*重量：≤ 2.0kg
*样本检测平台材质：304 不锈钢和石英
*输入电压：AC100～240V 50-60Hz
*操作电源功率：24W
关于我们
上海美析仪器公司简介
上海美析仪器有限公司(以下简称美析)，是一家具有自主知识产权的高新技术企业，美析的创业理念“科技——因你改变”，并以此为企业宗旨，不断探究、果敢创新。特别是在分析测试仪器领域，不断开发出先进的产品，使美析成为优质仪器资源的供应者。
美析主营光谱类仪器可见分光光度计、紫外可见分光光度计、原子吸收光谱仪、超微量分光光度计、原子荧光光度计、ICP电感耦合等离子体发射光谱仪、ICP电感耦合等离子体质谱仪，目前，我们的产品已广泛应用于有机化学、无机化学、生物化学、医药、环保、冶金、石油、农业等领域。同时美析利用在产品机械结构、光学设计、电气应用和软件开发方面积累的丰富经验，结合市场的最新实际需求，近期将陆续推出一批全新的分析类仪器。
美析的总部及生产基地设在上海，营销中心设在北京，并在江苏、上海、山东三地建有研发基地。为充分利用各地的智力资源，美析与国内外的部分科研单位也进行了深层次的科研合作，不断将科研成果转化为生产力。为更好的服务于广大客户，美析仪器国内设有12家办事机构，度身定制符合您需求的应用解决方案，提高产品的附加值。在不断服务国内用户同时，20多个国家的分销机构建立了深度的战略合作关系。
（美析仪器不仅仅只是一家高新技术认证企业，更通过了CE认证、FCC认证、RoHS认证以及国内多项资质审查认证，并有着多项自行研发的光谱类专利版权等等）
