民族药锐猫棍多糖及总糖含量测定
苗药锐猫棍,即有柄石韦,贵州水质偏硬的多民族地区,泌尿系统中的结石病较为常见,而锐猫棍(有柄石韦)常被用来治疗该疾病,是贵州民间常用民族药物。有柄石韦在《神农本草经》一书中被记载具有多种药用功效,包括利尿通淋、清肺止咳以及凉血止血等。基于这些传统用途,市场上出现了许多以有柄石韦为主要成分的中成药,这些药品主要用于实现利尿和通淋的效果,其中包括复方石韦片、复方石韦颗粒和复方石韦胶囊等多种制剂。
有柄石韦富含黄酮类、酚酸类、多糖等化学成分,但关于多糖在药物功效的协同作用研究文献较少。课题组前期已对黔产有柄石韦展开了大量化学成分及药理作用研究,筛选出了一批具有良好利尿通淋功效的活性化合物,并在体内外实验中得到了验证。但中药民族药多为多成分调节的结果,为研究有柄石韦多糖在其利尿通淋的协作机制,本课题组拟对其多糖及总糖进行研究。
1 仪器与材料
1.1主要仪器
紫外可见分光光度计(上海美析仪器有限公司);离心机;电热鼓风干燥箱;分析天平;水浴锅。
1.2试剂与材料
无水乙醇、石油醚、95%乙醇、正丁醇(分析纯AR,天津市富宇精细化工有限公司);5%苯酚、98%浓硫酸(重庆川东化工集团有限公司);蒸馏水、葡萄糖(分析纯AR,国药集团化学试剂有限公司)。
1.3样品
锐猫棍
2方法与结果
2.1对照品溶液的制备
在对无水葡萄糖进行105℃干燥至恒重后,精确称取545.6mg的样品并将其置入一个1000mL的量瓶中,接着加水进行溶解,并稀释至刻度,充分混匀后即可获得浓度为545.6mg/L的葡萄糖溶液。接下来,从这一溶液中精确吸取15mL,并定容至25mL,从而制备出浓度为327.36mg/L的对照品溶液。然后,分别吸取0.0mL、0.3mL、0.6mL、0.9mL、1.2mL、1.5mL和1.8mL的葡萄糖对照品溶液,放置于25mL的比色管中,利用蒸馏水补足至2mL,随后精确加入3mL的浓硫酸和1mL的5%苯酚溶液,充分混合后放置在沸水中加热15分钟。取出后放入冷水中冷却5分钟,再次取出并在490nm的波长下测量吸收度。通过将吸收度A作为纵坐标,浓度C作为横坐标绘制出标准曲线。
2.2供试品溶液制备
有柄石韦的供试样品首先经过风干处理,随后粉碎,再在60℃的环境下烘干至恒重。接着,取约1.0g的供试样品进行精密称定,按照“2.3.2”项下的操作步骤进行脱脂和色素的提取,以及去除其中的单糖、低聚糖及醇溶性杂质。随后,样品在100℃的水浴中进行三次提取,最后将滤液合并、浓缩,并将体积定容至100mL。最后,精密吸取10mL的浓缩液,并用水稀释至50mL,从而得到所需的实验溶液。
2.3多糖的测定
2.3.1半透膜的制备 取10mL火棉胶溶液,缓缓将其倒入150mL的锥形瓶中。在此过程中,小心地旋转锥形瓶,使得火棉胶在瓶壁上形成一层厚薄均匀的薄膜。随后,将多余的火棉胶液体倒回原瓶中。接着,将锥形瓶倒置于铁架台的铁圈上,等待剩余的火棉胶完全流尽。待溶液充分挥发后,轻轻用手指触碰火棉胶表面,直至不再感到粘手为止。此时,往锥形瓶中注满水,浸10min,倒去瓶中的水,然后在瓶口揭开一部分膜,在膜与瓶壁间加入适量的水,使膜与瓶壁分开,轻轻取出薄膜,半透膜灌水悬空,袋中水能逐渐渗出为合格。
2.3.2多糖的提取与精制 取自风干的黔产有柄石韦样品,首先将其粉碎,并在60℃的环境下烘干至恒重。接着,精确称取30g的有柄石韦粉末,用纸包好放置于索氏提取器中,经过石油醚的回流提取,以去除脂肪及色素,重复提取两次,每次持续3小时。提取后的液体被弃置,药渣在挥去溶媒后,随后进行80%乙醇的回流提取,同样进行两次,每次持续4小时。在再次处理完药渣后,加入蒸馏水并在100℃的水浴中提取三次,使用250mL、200mL和200mL的水,每次提取时间为2小时。提取后的药液随后合并,通过抽滤进行浓缩,然后使用Sevage法离心以去除蛋白质,转速为3000r/min,从而获得多糖溶液。接下来的步骤是将该溶液置于半透膜中进行24小时的滴水透析,随后添加无水乙醇以使乙醇的质量分数达到80%。此混合物在4℃的冰箱中静置24小时。最后,离心处理以获得多糖沉淀,并用丙酮、氯仿和无水乙醇进行两次洗涤,最后在60℃条件下烘干至恒重,从而得到纯化的有柄石韦多糖,存放于干燥器中以备后用。
2.3.3换算因素的测定 精确称取60℃下干燥至恒重的有柄石韦多糖4.0mg(共6份),将其溶解并定容至50mL。然后,精确量取2mL溶液置于25mL比色管中,依次加入3mL浓硫酸和1mL的5%苯酚溶液,充分混匀后,将比色管置于沸水中加热15分钟。随后取出比色管,放置于冷水中冷却5分钟。最后,在490nm波长处测定其吸收度。结果:平均换算因素f=1.164,RSD为0.3%。
2.3.4方法学考察 精密度试验中,我们精确吸取了2.0mL的黔产有柄石韦供试品溶液,并进行了六次快速连续的吸光度测定。根据标准曲线的条件进行分析,结果显示平均吸光度为0.4420,且相对标准偏差(RSD)为0.95%,这表明仪器在精密度方面表现良好。
在稳定性试验中,我们同样精确吸取了2.0mL的石韦供试品溶液,并按照标准曲线的要求进行了操作。每隔0.5小时测定一次吸光度,共进行六次测定。结果显示平均吸光度为0.4417,RSD为0.64%,这说明仪器具备良好的稳定性。
进行重复性试验时,我们精密称取了6份1.0g的黔产有柄石韦样品粉末,并按照供试品的制备方法制备供试液,遵循标准曲线的条件进行测定。结果显示平均含量为4.950%,且RSD为0.8%,表明具有较好的重复性。
在回收率试验中,我们称取了9份0.5g的黔产有柄石韦样品粉末,经石油醚和乙醇提取后,分别按样品量的80%、100%、120%添加葡萄糖对照品溶液(各3份)。随后,按照有柄石韦供试品的制备方法制备供试液并进行测定。结果显示平均回收率为99.40%,RSD为0.94%,这表明该方法具有良好的回收率。
2.3.5样品中多糖的测定 首先,准确称取有柄石韦供试品1.0g,共准备6份样品。接着,按照既定的供试品溶液制备方法进行供试液的制备,随后进行相应的测定。
2.4总糖的测定
2.4.1总糖的提取及供试品溶液的制备 选取风干的黔产有柄石韦样品后,将其粉碎,然后在60℃的环境下进行烘干,直到样品达到恒重状态。接着,精确称量1.0g的石韦粉末,放入索氏提取器内,使用石油醚进行回流提取,以去除样品中的脂质和色素,此过程重复进行两次,每次持续3小时。在完成提取后,弃去提取液。随后,将药渣中的溶剂挥发掉,在100℃的水浴中,向药渣中加入50mL的水,进行三次提取,提取时间为3小时、2小时和2小时。最后,将所得滤液合并,进行浓缩,并调整体积至100mL。从中取出2mL的母液,再稀释定容至25mL,即可得到所需的提取液。
2.4.2样品总糖的测定 精密称取1.0g有柄石韦样品(共6份),然后按照预定的供试品溶液制备方法制备供试液,并进行相关测定。
方法来源:[1]吕振涛,胡春梅,杨武德.民族药锐猫棍多糖及总糖含量测定[J].微量元素与健康研究,2024,41(06):62-64.