酶一比色法测定食品中的蔗糖
酶一比色法测定食品中的蔗糖
引言在食品生产中，测定蔗糖的含量可以判断食品加工原料的成熟度，鉴别白糖、蜂蜜等食品原料的品质，以及控制糖果、果脯、加糖乳制品等产品的质量指标。但蔗糖是葡萄糖和果糖组成的双糖，没有还原性，不能用碱性铜盐直接测定，通过一定条件处理，蔗糖水解为具有还原性的葡萄糖和果糖，可以用还原糖测定方法测定蔗糖含量。食品中蔗糖的测定方法除酸水解方法外，还有酶比色法。
酶一比色法的原理
在β一D一果糖苷酶(β一FS)催化下，蔗糖被酶解为葡萄糖和果糖。葡萄糖氧化酶(GOD)在有氧条件下，催化β一D一葡萄糖(葡萄糖水溶液状态)氧化，生成D一葡萄糖酸一δ内酯和过氧化氢。受过氧化物酶(POD)催化，过氧化氢与4一氨基安替吡啉和苯酚生成红色醌亚胺。在波长505nm处测定醌亚胺的吸光度，计算食品中蔗糖的含量。本法适用于各类食品中蔗糖的测定，由于β一D一果糖苷酶具有专一性，只能催化蔗糖水解，不受其他糖干扰，因此比盐酸水解法准确，最低检出限量为0.04μg／mL。
仪器及试剂
①分析筛。
②研钵或粉碎机。
③组织捣碎机。
④恒温水浴锅。
⑥微量移液管。
(1)组合试剂
1号瓶：内含β一D一果糖苷酶400U(活力单位)、柠檬酸、柠檬酸三钠。
2号瓶：内含0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH一7.0)l00mL，其中含4一氨基安替吡啉0.00154mol/L。
3号瓶：内含0.022mol／L苯酚溶液200mL。
4号瓶：内含葡萄糖氧化酶800U(活力单位)、过氧化物酶2000U(活力单位)。
1～4号瓶须在4℃左右保存。
(2)酶试剂溶液
①将1号瓶中的物质用重蒸馏水溶解，使其体积为66mL，轻轻摇动，使酶完全溶解，此溶液即为β-D果糖苷酶试剂，其中柠檬酸(缓冲溶液)浓度为0.1mol／L，pH=4.6，在4℃左右保存，有效期1个月。
②将2号瓶与3号瓶中的溶液充分混合。
③将4号瓶中的酶溶解在上述混合液中，轻轻摇动(勿剧烈摇动)，使酶完全溶解，即为葡萄糖氧化酶过氧化物酶试剂溶液，在4℃左右保存，有效期1个月。
(3)0.85mOL／L 亚铁氰化钾溶液 称取3.7g亚铁氰化钾，溶于100mL。重蒸馏水中，摇匀。
(4)0.25mOL／L 硫酸锌溶液称取7.7g硫酸锌(ZnSO4·7H2O)，溶于lOOmL重蒸馏水中，摇匀。
(5)氢氧化钠溶液0.1mOL／L。
(6)蔗糖标准溶液称取经(100±2)℃烘烤2h的蔗糖0．4000g，溶于重蒸馏水中，定容至100mL，摇匀。将此溶液10mL用重蒸馏水稀释至100mL，即为400g／mL蔗糖标准溶液。
标准曲线的绘制
用微量移液管取0、0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.00mL蔗糖标准溶液，分别置于10mL比色管中，各加入lmLβ-D果糖苷酶试剂溶液，摇匀，在(36±1)℃的水浴锅中恒温20min，取出后加入3mL葡萄糖氧化酶--过氧化物酶试剂溶液，在(36±1)℃的水浴锅中恒温40min，冷却至室温，用重蒸馏水定容，摇匀。用1cm比色皿，以蔗糖标准溶液含量为0的试剂溶液调整分光光度计的零点，在波长505nm处，测定各比色管中溶液的吸光度，以蔗糖含量为纵坐标，吸光度为横坐标，绘制标准曲线。
试液吸光度的测定
0.20～5.00mL试液(依试液中蔗糖的含量而定)，置于10mL比色管中，加入1mL一βD一果糖苷酶试剂溶液，摇匀，在(36±1)℃的水浴锅中恒温20min，取出后加入3mL葡萄糖氧化酶一过氧化物酶试剂溶液，在(36±1)℃的水浴锅中恒温40min，冷却至室温，用重蒸馏水定容，摇匀。用lcm比色皿，以等量试液调整分光光度计的零点，在波长505nm处，测定比色管中溶液的吸光度。测出试液吸光度后，以蔗糖含量为纵坐标，吸光度为横坐标，绘制标准曲线，在标准曲线上查出对应的蔗糖含量。
结果计算
X=C/m*V2/V1*1/1000*1000*100
式中x——样品中蔗糖的质量分数，％；
c——在标准曲线上查出的试液中蔗糖的含量,μg；
m——试样的质量，g；
V1——试液的定容体积，mL。；
V2——测定时吸取试液的体积，mL。
注意事项
①本方法对β-D一果糖苷酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶有严格的技术要求。酶活力要求如下：β一D果糖苷酶酶活力(U／mg)≥100；葡萄糖氧化酶酶活力(u／mg)≥20；过氧化物酶酶活力(U／mg)≥50。
②各种酶都不得含有纤维素酶、淀粉葡萄糖苷酶、半乳糖苷酶和过氧化氢酶。
仪器参数
V-1500CPC可见分光光度计
仪器特点
*主机中文操作系统，7英寸彩色触摸屏显示
*宽大的触摸屏可显示多组数据，菜单显示，可直接显示图谱
*巨大的内存空间，可存储多组数据和曲线
*自动调0、调100%功能
*波长自动调节
*滤色片自动切换
*宽大样品池（5mm～100mm）
*具有最多十点标样建标准曲线测量功能
*可通过直接输入K、B因子建立标准曲线进行定量测量
*可直接输入标样和对应浓度值建立标准曲线进行定量测量
*可断电保存测量设置的标准曲线参数
*配备通用并行打印接口，可打印标题栏、测量数据、曲线参数、曲线标准样品点和曲线
*支持外接U盘存储及传输实验数据
*可通过PC软件控制实现光谱扫描等更精确和灵活的测量要求
技术指标及基本参数
*光路结构：C-T式
*波长范围： 320～1100nm
*光谱带宽： 2nm
*波长准确度：±0.5nm
*波长重现性：≤0.2nm
*透射比准确度: ±0.3% τ
*透射比重复性：0.15% τ
*杂散光：≤0.04% τ (340nm NaNO2)
*稳定性： 0.001A/h（500nm预热后）
*测光方式：透过率、吸光度、浓度、能量
*波长调节：自动调节
*光度范围： -0.3～3A
*显示方式：7英寸彩色触摸屏
*检测器：进口硅光二极管
*光源：进口钨灯
*电源： AC 220V/50Hz或110V/60Hz
*功率： 120W
*仪器尺寸：480×350×220mm
*主机净重： 11Kg
关于我们
上海美析仪器公司简介
上海美析仪器有限公司(以下简称美析)，是一家具有自主知识产权的高新技术企业，美析的创业理念“科技——因你改变”，并以此为企业宗旨，不断探究、果敢创新。特别是在分析测试仪器领域，不断开发出先进的产品，使美析成为优质仪器资源的供应者。
美析主营光谱类仪器可见分光光度计、紫外可见分光光度计、原子吸收光谱仪、超微量分光光度计、原子荧光光度计、ICP电感耦合等离子体发射光谱仪、ICP电感耦合等离子体质谱仪，目前，我们的产品已广泛应用于有机化学、无机化学、生物化学、医药、环保、冶金、石油、农业等领域。同时美析利用在产品机械结构、光学设计、电气应用和软件开发方面积累的丰富经验，结合市场的最新实际需求，近期将陆续推出一批全新的分析类仪器。
美析的总部及生产基地设在上海，营销中心设在北京，并在江苏、上海、山东三地建有研发基地。为充分利用各地的智力资源，美析与国内外的部分科研单位也进行了深层次的科研合作，不断将科研成果转化为生产力。为更好的服务于广大客户，美析仪器国内设有12家办事机构，度身定制符合您需求的应用解决方案，提高产品的附加值。在不断服务国内用户的同时，美析也与20多个国家的分销机构建立了深度的战略合作关系。
（美析仪器不仅仅只是一家高新技术认证企业，更通过了CE认证、FCC认证、RoHS认证以及国内多项资质审查认证，并有着多项自行研发的光谱类专利版权等等）
