3.5-二硝基水杨酸比色法测定还原糖和总糖的方案
3.5-二硝基水杨酸比色法测定还原糖和总糖的方案
目的掌握还原糖和总糖测定的基本原理，学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。
原理
还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖,其中乳糖和麦芽糖是还原糖,蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。
还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物,3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。
仪器及试剂
( 1 ) lmg/mL，葡萄糖标准液3.5-二硝基水杨酸比色法测定还原糖和总糖的方案
准确称取8O℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL，容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，混匀，4℃冰箱中保存备用。
(2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂
将6.3gDNS 和 262mL，2M NaOH 溶液，加到500mL含有185g 酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和 5g 亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中备用。
(3）碘-碘化钾溶液:称取5g碘和10g碘化钾，溶于100mL蒸馏水中。
(4）酚酞指示剂:称取0.1g酚酞，溶于250mL70%乙醇中。
(5)6M HCl和 6M NaOH各100mL。
实验步骤
1．制作葡萄糖标准曲线
取7支20mL具塞刻度试管编号，分别加入浓度为1mg/mL的葡萄糖标准液、吸取葡萄糖标液（1mg/mL）0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2ml，葡萄糖含量为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mg，加入 3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂1.5ml，用蒸馏水稀释至2ml，配成不同葡萄糖含量的反应液。
2．样品中还原糖和总糖的测定(1）还原糖的提取
准确称取3.00g食用面粉，放入100mL烧杯中，先用少量蒸馏水调成糊状，然后加入50mL蒸馏水，搅匀，置于50℃恒温水浴中保温20min，使还原糖浸出。将浸出液（含沉淀）转移到50mL离心管中，于4000r/min下离心5min,沉淀可用20mL蒸馏水洗一次，再离心，将二次离心的上清液收集在100mL 容量瓶中,用蒸馏水定容至刻度,混匀，作为还原糖待测液。(2）总糖的水解和提取
准确称取1.00g食用面粉，放入100mL三角瓶中，加15mL蒸馏水及10mL 6M HCl，置沸水浴中加热水解30min(水解是否完全可用碘-碘化钾溶液检查)。待三角瓶中的水解液冷却后，加入1滴酚酞指示剂，用6mol/LNaOH中和至微红色,用蒸馏水定容在100mL 容量瓶中，混匀。将定容后的水解液过滤，取滤液10mL，移入另一100mL'容量瓶中定容，混匀，作为总糖待测液。
(3）显色和比色
取4支20mL具塞刻度试管，编号，按表2所示分别加入待测液和显色剂，空白调零可使用
制作标准曲线的0号管。加热、定容和比色等其余操作与制作标准曲线相同。
结果与计算
计算出7、8号管光密度值的平均值和9、10管光密度值的平均值，在标准曲线上分别查出相应的还原糖毫克数，按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量。
仪器参数
V-1500PC可见分光光度计
仪器特点
*采用单片微机控制，128*64位液晶显示
*宽大的液晶显示器可显示多组数据
*巨大的内存空间，可存储多组数据和曲线
*自动调0、调100%功能
*波长自动调节
*滤色片自动切换
*宽大样品池（5mm～100mm）
*具有最多十点标样建标准曲线测量功能
*可通过直接输入K、B因子建立标准曲线进行定量测量
*可直接输入标样和对应浓度值建立标准曲线进行定量测量
*可断电保存测量设置的标准曲线参数
*配备通用并行打印接口，可打印标题栏、测量数据、曲线参数、曲线标准样品点和曲线
*配USB接口
*可通过PC软件控制实现光谱扫描等更精确和灵活的测量要求
技术指标及基本参数
*波长范围： 320～1100nm
*光谱带宽： 2nm
*波长准确度：±0.5nm
*波长重现性：≤0.2nm
*透射比准确度: ±0.3% τ
*透射比重复性：0.15% τ
*杂散光：≤0.05% τ (340nm NaNO2)
*稳定性： 0.001A/h（500nm预热后）
*测光方式：透过率、吸光度、浓度、能量
*波长调节：自动调节
*光度范围： -0.3～3A
*显示方式： 128*64液晶
*检测器：进口硅光二极管
*光源：进口钨灯
*电源： AC 220V/50Hz或110V/60Hz
*功率： 120W
*仪器尺寸：480×350×220mm
*主机净重： 11Kg
关于我们
上海美析仪器公司简介
上海美析仪器有限公司(以下简称美析)，是一家具有自主知识产权的高新技术企业，美析的创业理念“科技——因你改变”，并以此为企业宗旨，不断探究、果敢创新。特别是在分析测试仪器领域，不断开发出先进的产品，使美析成为优质仪器资源的供应者。
美析主营光谱类仪器可见分光光度计、紫外可见分光光度计、原子吸收光谱仪、超微量分光光度计、原子荧光光度计、ICP电感耦合等离子体发射光谱仪、ICP电感耦合等离子体质谱仪，目前，我们的产品已广泛应用于有机化学、无机化学、生物化学、医药、环保、冶金、石油、农业等领域。同时美析利用在产品机械结构、光学设计、电气应用和软件开发方面积累的丰富经验，结合市场的最新实际需求，近期将陆续推出一批全新的分析类仪器。
美析的总部及生产基地设在上海，营销中心设在北京，并在江苏、上海、山东三地建有研发基地。为充分利用各地的智力资源，美析与国内外的部分科研单位也进行了深层次的科研合作，不断将科研成果转化为生产力。为更好的服务于广大客户，美析仪器国内设有12家办事机构，度身定制符合您需求的应用解决方案，提高产品的附加值。在不断服务国内用户的同时，美析也与20多个国家的分销机构建立了深度的战略合作关系。
（美析仪器不仅仅只是一家高新技术认证企业，更通过了CE认证、FCC认证、RoHS认证以及国内多项资质审查认证，并有着多项自行研发的光谱类专利版权等等）
