基于纳米银培养基的紫外-可见光谱法 快速检测中药微生物

引 言

2025版《中华人民共和国药典》(以下简称《中国药典》)中对多种中药饮片的微生物限度提出明确要求,为此需采取有效的检测技术,准确检测中药饮片的微生物污染情况,以确保用药安全性。微生物体积微小,肉眼无法察觉,传统的检测技术存在成本偏高、监测耗时长等缺陷,无法满足大批量检测的要求。基于纳米银(silvernanoparticles,AgNPs)培养基的紫外-可见光谱法的主要特点是利用 AgNPs培养基完成微生物培养,在190~800nm波长范围测定为物质的吸光度,进而满足定量检测、杂质检查、鉴别等要求。基于 AgNPs培养基的紫外-可见光谱法检测操作简单、灵敏度较高,利用AgNPs培养基进行微生物培养可规避多种影响因素,保证检测结果的准确度,紫外-可见光能够直接作用于微生物,200~400nm波长范围能够敏感的发现微生物内部核酸等物质,通过对光谱信息的分析能够确定微生物的种类。目前应用的紫外-可见光谱法存在检测背景单一的问题,由于中药成分复杂,仅通过一维光谱检测难以达到理想的检测效果,为此本研究对基于 AgNPs培养基的紫外-可见光谱法进行创新,采用二维相关光谱技术,使一维空间的光谱数字信号转变为二维空间光谱数字信号,可明显提高光谱的综合分辨率,提升检测结果的灵敏度及精确度,进而确定中药微生物的种类。本研究选择中药桑寄生、两头尖样本,分析该方法的具体操作方案及检测结果,研究应用该方法进行中药微生物污染快速大批量检测的价值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 样品

选择两头尖共11批次,产地为陕西、山东、江苏、黑龙江、吉林、湖北。桑寄生共12批次,产地为安徽、吉林、广东、广西。全部样本均在特定存放室阴凉处存放备用。

1.1.2 菌种

金黄色葡萄球菌(CMCC(B)26003)、大肠埃希菌(CMCC(B)44102)、铜绿假单胞菌(CMCC(B)10104)、乙型副伤寒沙门菌(CMCC(B)50094)、白色念珠菌(CMCC(B)98001)、乙型溶血性链球菌(CMCC(B)32210)、福氏志贺菌(CMCC(B)51572)。CMCC为中国医学细菌保藏管理中心,使用前参照《中国药典》要求配制为菌落数为100CFU/mL以下的菌液。

1.1.3 培养基

选用培养基为 AgNPs培养基、哥伦比亚CAN血琼脂培养基、胰酪大豆胨琼脂培养基(tryptosesoyaagar,TSA)、沙氏葡萄糖琼脂培养基(sabourauddextroseagar,SDA)、胰酪大豆胨液体培养基(trypticsoybroth,TSB)、改良胰蛋白胨大豆肉汤培养基、RV 沙门菌增菌液体培养基、pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液、康凯液体培养基、三糖铁琼脂培养基(triplesugarironagar,TSI)、紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基、甘露醇氯化钠琼脂培养基、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基、肠道菌增菌液体培养基、肉汤培养基、麦康凯琼脂培养基、沙氏葡萄糖液体培养基、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基、哥伦比亚血琼脂培养基,全部培养基均为干粉培养基。

1.1.4 实验仪器及参数

紫外-可见光分光光度计、电子天平(精度为0.001g)、移液枪(精度±0.8μL)、电热恒温培养箱(温差±0.9℃)。

1.2 实验方法

1.2.1 制备供试液

取中药样品25g,加入pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液225mL,摇晃振荡约10min,获取上清液占比为1∶10的供试液。

1.2.2 微生物活化与分离

取AgNPs培养基对微生物实施选择性培养,将培养基相关溶液及空白培养皿置入温度为121℃的高温灭菌箱内,设定压力位103.4kPa,灭菌时间为15~30min。完成灭菌后将空白培养皿置于无菌台表面,将灭菌后的培养基冷却至50℃左右(避免高温杀死微生物),倒入培养皿凝固成平板,供试液加热至37℃后加入培养皿中。完成上述操作后接种菌种,将菌株接种至复苏液中,间隔5min,采用平板划线法将菌株溶液接种至培养皿中,将培养皿放置于37℃恒温箱,培养18h。

1.2.3 微生物扩繁及纯化

称量LB肉汤,按照LB肉汤10g与蒸馏水800mL的比例加入液 体,高 压高 温 [温度 (115~126 ℃)、压力 (67~139kPa)]灭菌处理,温度降低至37℃后备用。选择独立生长的单个菌落实施扩繁培养,AgNPs培养基表面金黄色葡萄球菌菌落金黄色、圆形、凸起、表面光滑,大肠杆菌菌落灰白色、圆形、边缘整齐、表面湿润,酵母菌为乳白色。挑取单个菌落至预先准备的培养基中,二者混合均匀,培养基置于培养箱,37℃下持续培养18h。完成培养后,将分离及扩繁处理的菌液置入离心管内部,实施离心(3000r/min离心5min)、去离子水洗涤、清除上清液等处理,随后摇匀,再次离心(5000r/min离心10min),获得菌悬液。

1.2.4 麦氏比浊法

配制麦氏比浊标准管(0.5号),参照标准为1.5×108CFU/mL,1%硫酸(H2SO4)和1.175%氯化钡(BaCl2·2H2O)反应生成硫酸钡沉淀,形成稳定的悬浊液,利用移液枪采集有效作用浓度为0.015%的硫酸钡溶液0.05mL至麦氏比浊标准管内部。在无菌条件下取适量微生物菌悬液置入无菌试管内部,加入适量去离子水,使菌悬液浓度为108 CFU/mL。

1.2.5 采集光谱数据

在预先配制的供试液加入配制好的微生物悬浊液,比例为1mL供试液中加入1mL菌液,浓度分别为5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%,完成操作后加入去离子水,使液体总量达到21mL,各浓度梯度样品均配制3份,共获得63份(7×3×3)样品。启动紫外-可见分光光度计,预热温度为5~35℃,预热时间20~30min,光源能量供应处于稳定的状态后,规范完成光谱数据样本信息采集,在采集标准样品前需在7个比色皿中加入纯净水,将其作为空白样品,随后前后2个液体池中,对仪器的基准线进行矫正。在测量过程中确保对照组的空白样品不发生变化。采用光谱扫描方式,顺次将待测样品池中的样品更换为不同浓度梯度的样品,取样的间隔设定为0.5nm,量前将样品充分摇匀”;同一浓度3份平行样品,每份测1次,取平均值;扫描波长范围(如400~800nm)。

1.2.6 光谱原始数据及特征分析

完成检测后,采集中药微生物紫外光谱,共获取189组原始数据,每组波长吸光度值为601个。以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、酵母菌为例,金黄色葡萄球菌加入中药供试液后,在200~300nm区间吸收特性不佳,在300nm后产生多个吸收峰,首个吸收峰的分布区域为334nm。大肠杆菌加入中药供试液后,在200~300nm区间吸收特性不佳,在300nm 后产生多个吸收峰,首个吸收峰的分布区域为331nm,且中药含有脂肪球、酪蛋白胶颗粒等吸光物质,导致中药供试液总体吸光度处于较高的水平,在紫外-可见光波动大肠杆菌的主要吸光物质包括色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸,吸光波长为279、259、278nm。酵母菌加入中药供试液后,在200~300nm 区间吸收特性 不 佳,在 300nm 后产 生 多 个吸 收 峰,在 300~350nm区间其展现的光谱曲线未呈现统一上升的趋势,主要原因为酵母菌分布不均匀及大小不一,观察后发现首个吸收峰的位置为337nm,不同组分之间的吸光物质存在重合。

2 结果与分析

两头尖共11批次,桑寄生共12批次微生物污染严重,其中两头尖需氧菌最高含量达1600000CFU/g,霉菌、酵母菌最高含量达1200CFU/g,耐热菌最高含量达18CFU/g。桑寄生需氧菌最高含量达21000000CFU/g,霉菌、酵母菌最高含量达51000CFU/g,耐热菌最高含量达35CFU/g。见表1、表2。

3 讨论与结论

为保证中药饮片的用药安全性及有效性,《中国药典》等权威文献对中药饮片中微生物的限度提出明确要求,旨在促进中药国际化及现代化发展。为此,相关机构在开展中药质量检测的过程中,需选择检测效果最高的技术方案进行微生物检测,以确保上市销售的各类中药饮片微生物限度均处于合理的范围中[5]。

本研究的数据资料显示,两头尖共11批次,桑寄生共12批次微生物污染严重,检出一定量的需氧菌、霉菌、酵母菌、耐热菌。控制菌检查结果显示,两头尖共11批次,桑寄生12批次检出特殊类型微生物、耐胆盐革兰阴性菌、典型细菌,检测结果与胡玉霞等研究结论近似,据此认为基于 AgNPs培养基的紫外-可见光谱法可快速准确检测中药微生物含量。对检测结果进行分析可知,耐热菌的主要类型为产芽孢菌与孢子,其主要特点是耐热性强,难以杀灭。药典中并未对耐热菌的上限做出明确的规定,但中药在煎煮后仍无法完全杀灭耐热菌,因此需重视其危害性,并采取有效的措施将其彻底清除。耐胆盐革兰阴性菌属于非乳糖发酵菌,可耐受胆盐,并能够充分利用葡萄糖,药典已经将其纳入为必检的微生物范畴。不同类型中药饮片中需氧菌、霉菌、酵母菌的污染情况存在较大差异,药典中并未进行统一规定,相关企业可结合实际情况确定具体控制方案。通过上述分析能够发现,基于AgNPs培养基的紫外-可见光谱法能够在较短的时间内完成对中药微生物污染情况的检测,但对于技术人员的操作水平有较高的要求。为此,在应用该技术检测过程中,需明确检测结果的影响因素,并结合实际情况优化调整检测流程,在采集光谱数据的过程中需多次测量后取平均值,并掌握各种微生物的光谱特征,以确保检测结果的准确性。

综上,基于 AgNPs培养基的紫外-可见光谱法可快速准确检测中药微生物污染情况,具有推广应用价值。同时,本研究开展的总时间比较短,选取中药饮片样本量不足,未来在进行中药微生物检测过程中需优化检测流程,控制各种检测结果的影响因素,规范完成操作,以保证检测结果准确。

文章来源：[1]沈心.基于纳米银培养基的紫外-可见光谱法快速检测中药微生物[J].实验室检测,2025,3(17):92-94.